Новини

Полимеразна верижна реакция (PCR)

AP.BIO:

IST‑1 (ЕС)

,

IST‑1.P (LO)

,

IST‑1.P.1 (EK)

Техника, използвана за усилване или правене на много копия на специфичен целеви регион на ДНК.

 

Ключови точки:

  • Полимеразна верижна реакция, или PCR, е техника за създаване на много копия на специфичен ДНК регион инвитро (в епруветка, а не в организъм).
  • PCR разчита на термостабилна ДНК полимераза, Taq полимеразаи изисква ДНК грундове проектирани специално за интересуващата ни ДНК област.
  • При PCR реакцията многократно преминава през серия от температурни промени, които позволяват да се произвеждат много копия от целевия регион.
  • PCR има много изследвания и практически приложения. Той се използва рутинно при клониране на ДНК, медицинска диагностика и криминалистичен анализ на ДНК.

Какво е PCR?

Полимеразна верижна реакция (PCR) е често срещана лабораторна техника, използвана за създаване на много копия (милиони или милиарди!) на определен регион на ДНК. Тази ДНК област може да бъде всичко, от което експериментаторът се интересува. Например може да е ген, чиято функция изследователят иска да разбере, или генетичен маркер, използван от криминалистите, за да съпоставят ДНК на местопрестъплението с заподозрени.

Обикновено целта на PCR е да направи достатъчно от целевата ДНК област, за да може да бъде анализирана или използвана по някакъв друг начин. Например може да бъде изпратена ДНК, амплифицирана чрез PCR секвениране, визуализирано от гел електрофореза, или клониран в плазмид за по-нататъшни експерименти.

PCR се използва в много области на биологията и медицината, включително изследвания на молекулярната биология, медицинска диагностика и дори някои клонове на екологията.

Taq полимераза

като ДНК репликация в организма PCR изисква ензим ДНК полимераза, който създава нови вериги на ДНК, използвайки съществуващите вериги като шаблони. ДНК полимеразата, която обикновено се използва в PCR, се нарича Taq полимераза, след устойчивата на топлина бактерия, от която е изолирана (Tхермус aquaticus).

T. aquaticus живее в горещи извори и хидротермални извори. Неговата ДНК полимераза е много устойчива на топлина и е най-активна около 70 °\text C70°C70, °, начален текст, C, краен текст (температура, при която човек или Е. coli ДНК полимеразата би била нефункционална). Тази топлинна стабилност прави Taq полимераза идеална за PCR. Както ще видим, високата температура се използва многократно в PCR за денатуриране шаблонната ДНК или отделете нейните вериги.

PCR праймери

Подобно на други ДНК полимерази, Taq полимеразата може да създаде ДНК само ако й се даде a грунд, кратка последователност от нуклеотиди, която осигурява отправна точка за синтеза на ДНК. При PCR реакция експериментаторът определя участъка на ДНК, който ще бъде копиран или амплифициран от праймерите, които той или той избира.

PCR праймерите са къси парчета едноверижна ДНК, обикновено с дължина около 202020 нуклеотида. Във всяка PCR реакция се използват два праймера и те са проектирани така, че да обграждат целевия регион (регион, който трябва да бъде копиран). Това означава, че им се дават последователности, които ще ги накарат да се свържат с противоположни вериги на шаблонната ДНК, точно в краищата на региона, който трябва да бъде копиран. Праймерите се свързват с шаблона чрез комплементарно сдвояване на бази.

Шаблон ДНК:

5′ TATCAGATCCATGGAGT…GAGTACTAGTCCTATGAGT 3′ 3′ ATAGTCTAGGTACCTCA…CTCATGATCAGGATACTCA 5′

Грунд 1: 5′ CAGATCCATGG 3′ Грунд 2:

Когато праймерите са свързани с шаблона, те могат да бъдат разширени от полимеразата и областта, която се намира между тях, ще бъде копирана.

[По-подробна диаграма, показваща насочеността на ДНК и праймера]

Стъпките на PCR

Основните съставки на PCR реакцията са Taq полимераза, праймери, матрица ДНК и нуклеотиди (градивни елементи на ДНК). Съставките се събират в епруветка, заедно с кофактори, необходими на ензима, и се подлагат на повтарящи се цикли на нагряване и охлаждане, които позволяват да се синтезира ДНК.

Основните стъпки са:

  1. Денатурация (96 °\текст C96°C96, °, начален текст, C, краен текст): Загрейте силно реакцията, за да отделите или денатурирате ДНК нишките. Това осигурява едноверижен шаблон за следващата стъпка.
  2. Отгряване (555555 - 656565°\текст C°C°, начален текст, C, краен текст): Охладете реакцията, така че праймерите да могат да се свържат с техните комплементарни последователности върху едноверижната шаблонна ДНК.
  3. Удължаване (72 °\текст C72°C72, °, начален текст, C, краен текст): Повишете температурите на реакцията, така че Taq полимеразата разширява праймерите, синтезирайки нови вериги на ДНК.

Този цикъл се повтаря 252525 - 353535 пъти в типична PCR реакция, която обикновено отнема 222 - 444 часа, в зависимост от дължината на ДНК региона, който се копира. Ако реакцията е ефективна (работи добре), целевият регион може да премине от само едно или няколко копия до милиарди.

Това е така, защото не само оригиналната ДНК се използва като шаблон всеки път. Вместо това, новата ДНК, която е направена в един кръг, може да служи като шаблон в следващия кръг на синтеза на ДНК. Има много копия на праймерите и много молекули на Taq полимераза, плаваща наоколо в реакцията, така че броят на ДНК молекулите може грубо да се удвои във всеки кръг от цикли. Този модел на експоненциален растеж е показан на изображението по-долу.

Използване на гел електрофореза за визуализиране на резултатите от PCR

Резултатите от PCR реакция обикновено се визуализират (правят видими) с помощта гел електрофорезаГел електрофореза е техника, при която фрагменти от ДНК се изтеглят през гел матрица чрез електрически ток и разделя ДНК фрагментите според размера. Стандартна или ДНК стълба обикновено се включва, за да може да се определи размерът на фрагментите в PCR пробата.

ДНК фрагменти със същата дължина образуват "лента" върху гела, която може да се види с око, ако гелът е оцветен с ДНК-свързващо багрило. Например, PCR реакция, произвеждаща фрагмент от 400400400 базови двойки (bp), би изглеждала така върху гел:

Ляво платно: ДНК стълба с ленти от 100, 200, 300, 400, 500 bp.

Дясна лента: резултат от PCR реакция, лента при 400 bp.

ДНК лентата съдържа много, много копия от целевата ДНК област, а не само едно или няколко копия. Тъй като ДНК е микроскопична, много копия от нея трябва да присъстват, преди да можем да я видим на око. Това е голяма част от това защо PCR е важен инструмент: той произвежда достатъчно копия на ДНК последователност, която можем да видим или да манипулираме този регион на ДНК.

Приложения на PCR

Използвайки PCR, ДНК последователност може да бъде амплифицирана милиони или милиарди пъти, произвеждайки достатъчно ДНК копия, които да бъдат анализирани с други техники. Например, ДНК може да бъде визуализирана чрез гел електрофореза, изпратена за секвениране, или усвоен с рестрикционни ензими и клониран в плазмид.

PCR се използва в много изследователски лаборатории, а също така има практически приложения в криминалистиката, генетичното тестване и диагностиката. Например, PCR се използва за амплифициране на гени, свързани с генетични нарушения от ДНК на пациентите (или от фетална ДНК, в случай на пренатално тестване). PCR може да се използва и за тестване на бактерия или ДНК вирус в тялото на пациента: ако патогенът присъства, може да е възможно да се амплифицират области от неговата ДНК от кръвна или тъканна проба.

Примерен проблем: PCR в криминалистиката

Да предположим, че работите в лаборатория по криминалистика. Току-що получихте ДНК проба от косъм, оставен на местопрестъплението, заедно с ДНК проби от трима възможни заподозрени. Вашата задача е да изследвате конкретен генетичен маркер и да видите дали някой от тримата заподозрени съвпада с ДНК на косата за този маркер.

Маркерът се предлага в два алела или версии. Едната съдържа едно повторение (кафява област отдолу), докато другата съдържа две копия на повторението. При PCR реакция с праймери, които обграждат повторящата се област, първият алел произвежда 200200200 \text{bp}bpstart текст, b, p, краен текст ДНК фрагмент, докато вторият произвежда 300300300 \text{bp}bpstart текст, b , p, краен текст ДНК фрагмент:

Маркер алел 1: праймери, фланкиращи повторящата се област, амплифицират 200 bp фрагмент от ДНК

Маркер алел 2: праймери, фланкиращи повторящата се област, амплифицират 300 bp фрагмент от ДНК

Извършвате PCR върху четирите ДНК проби и визуализирате резултатите чрез гел електрофореза, както е показано по-долу:

Гелът има пет ленти:

Първа лента: ДНК стълба с ленти от 100, 200, 300, 400 и 500 bp.

Втора лента: ДНК от местопрестъплението, лента от 200 bp.

Трета лента: ДНК на заподозрян номер 1, лента от 300 bp.

Четвърта лента: ДНК на заподозрян номер 2, 200 и 300 bp ленти.

Пета лента: ДНК на заподозрян #3, лента от 200 bp.

ДНК на кой заподозрян съвпада с ДНК от местопрестъплението на този маркер?

Изберете 1 отговор:

Изберете 1 отговор:

(Избор А)

A

Заподозрян 111

(Избор Б)

B

Заподозрян 222

(Избор C)

C

Заподозрян 333

(Избор D)

D

Никой от заподозрените

[Съвет]

Не можахме да оценим отговора ви. Изглежда, че сте оставили нещо празно или сте въвели невалиден отговор.

Проверете

Повече за PCR и криминалистиката

При реални криминалистични тестове на ДНК от местопрестъпление, техниците биха направили анализ, концептуално подобен на този в примера по-горе. Въпреки това, редица различни маркери (не само единичният маркер в примера) ще бъдат сравнени между ДНК на местопрестъплението и ДНК на заподозрените.

Освен това маркерите, използвани в типичен криминалистичен анализ, не се предлагат само в две различни форми. Вместо това те са високо полиморфен (поли = много, морф = форма). Тоест, те идват в много алели, които варират на малки стъпки по дължина.

Най-често използваният тип маркери в криминалистиката, т.нар кратки тандемни повторения (STRs), се състоят от много повтарящи се копия на една и съща къса нуклеотидна последователност (обикновено дълга от 222 до 555 нуклеотида). Един алел на STR може да има 202020 повторения, докато друг може да има 181818, а друг само 101010^11 начален горен индекс, 1, крайен горен индекс.

Чрез изследване на множество маркери, всеки от които се предлага в много алелни форми, криминалистите могат да изградят уникален генетичен „пръстов отпечатък“ от ДНК проба. При типичен STR анализ, използващ 131313 маркера, шансовете за фалшив положителен резултат (двама души, имащи един и същ ДНК „пръстов отпечатък“) са по-малко от 111 в 101010 \text{billion}начален текст, b, i, l, l, i, o, n, край на текста^11 начало на горния индекс, 1, край на горния индекс!

Въпреки че може да мислим за ДНК доказателства, използвани за осъждане на престъпници, те изиграха решаваща роля за оневиняването на фалшиво обвинени хора (включително някои, които са били в затвора в продължение на много години). Съдебният анализ се използва и за установяване на бащинство и за идентифициране на човешки останки от сцени на бедствие.

[Приписване и препратки]

Студент ли си или учител?

Студент Учител

 


Час на публикация: 08.01.2021 г